RKIP CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401270-ACT

ヒトPEBP1は、Rafキナーゼ阻害タンパク質（RKIP）をコードしており、RAF1–MEK–ERKシグナル伝達を抑制することでシグナル伝達を調節する保存性の高いモジュレーターである。また、GRK2を阻害することにより、GPCR経路にも影響を及ぼしうる。キナーゼシグナルのダイナミクスを形作ることで、RKIPは増殖、分化、ストレス応答、アポトーシス・プログラムの制御に寄与し、さらにMAPKおよびNF-κB関連ネットワークとのクロストークを介して、細胞運動性や上皮間葉転換（EMT）とも関連づけられている。PEBP1/RKIPの発現異常は、がん生物学や炎症性シグナル伝達など、複数の疾患関連コンテキストで報告されており、経路のバッファリング（緩衝）能の変化が浸潤性や治療応答の表現型に影響しうる。これらの特性により、PEBP1はヒト細胞モデルにおける経路フィードバック、キナーゼネットワークの再配線、ならびに状況依存的な転写出力を解析するための有用な結節点となる。

RKIP CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PEBP1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

RKIP CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PEBP1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPEBP1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性RKIPの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPEBP1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるRKIP依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPEBP1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるRKIP経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。