Plasmide CRISPR d'Activation (h) RKIP: sc-401270-ACT

Le gène humain PEBP1 code la protéine inhibitrice de la kinase Raf (RKIP), un modulateur conservé de la transduction du signal qui freine la signalisation RAF1–MEK–ERK et peut influencer les voies des GPCR en inhibant GRK2. En façonnant la dynamique de la signalisation des kinases, RKIP contribue à la régulation de la prolifération, de la différenciation, des réponses au stress et des programmes apoptotiques, et a été associée à la motilité cellulaire et à la transition épithélio-mésenchymateuse via des interactions croisées avec les réseaux liés à la MAPK et à NF-κB. Une expression dérégulée de PEBP1/RKIP a été rapportée dans de multiples contextes pertinents pour les maladies, notamment en cancérologie et dans la signalisation inflammatoire, où une modification de l’amortissement des voies peut affecter le comportement invasif et les phénotypes de réponse aux traitements. Ces caractéristiques font de PEBP1 un nœud utile pour disséquer les rétroactions de voie, le recâblage des réseaux de kinases et les sorties transcriptionnelles dépendantes du contexte dans des modèles cellulaires humains.

RKIP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PEBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RKIP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PEBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PEBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RKIP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PEBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RKIP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RKIP dans les cellules tumorales présentant une expression de PEBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.