Ribosomal Protein L28 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405270-ACT

RPL28 kodiert das ribosomale Protein L28, eine zentrale Komponente der großen 60S-Untereinheit des Ribosoms, die für eine präzise Elongation der Translation und eine effiziente Ribosomenbiogenese erforderlich ist. Als Teil des nukleolären Ribosomen-Assemblierungswegs unterstützt RPL28 die rRNA-Prozessierung, die Reifung der großen Untereinheit und die Proteostase und verknüpft seine Aktivität damit mit der Kontrolle des Zellwachstums sowie einer stressadaptiven translationalen Reprogrammierung. Eine veränderte Expression oder Gen-Dosierung ribosomaler Proteine kann die globale und selektive mRNA-Translation stören und nukleoläre Stress-Signalwege aktivieren – Prozesse, die häufig in der Krebsbiologie und anderen Erkrankungen mit dysregulierter Proteinsynthese untersucht werden. RPL28 ist daher ein nützlicher Ausgangspunkt, um Ribosomenfunktion, Netzwerke der Translationskontrolle und nachgelagerte Effekte auf Zellzyklusprogression und metabolische Anpassung zu untersuchen.

Ribosomal Protein L28 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPL28-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ribosomal Protein L28 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPL28-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPL28-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ribosomal Protein L28-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPL28-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ribosomal Protein L28-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ribosomal Protein L28-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPL28-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.