RFC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402122-ACT

RFC1 kodiert den Replikationsfaktor C, Untereinheit 1, die große Untereinheit des RFC-Clamp-Loader-Komplexes, der PCNA auf die DNA lädt und so die hochprozessive Aktivität der DNA-Polymerase fördert. Dieser ATP-abhängige Prozess ist zentral für die DNA-Replikation, die Reifung der Okazaki-Fragmente und mehrere DNA-Reparaturwege, darunter die Nukleotidexzisionsreparatur, die Basenexzisionsreparatur und die Mismatch-Reparatur. Aufgrund seiner Rolle in Replikationsstressantworten und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität wird RFC1 häufig im Kontext der Zellzykluskontrolle und der DNA-Schadenssignalgebung untersucht. Eine fehlregulierte Aktivität des RFC1-Signalwegs ist relevant für proliferationsbezogene Biologie und Genominstabilitäts-Phänotypen, die häufig in Krebs und anderen DNA-Reparatur-assoziierten Erkrankungen modelliert werden.

RFC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RFC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RFC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RFC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RFC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RFC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RFC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RFC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RFC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RFC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.