Plasmide CRISPR d'Activation (h) REEP5: sc-405007-ACT

REEP5 (receptor expression-enhancing protein 5) est une protéine membranaire résidente du réticulum endoplasmique (RE) qui contribue à façonner les tubules du RE et à soutenir l’organisation RE–membrane plasmique, favorisant ainsi le trafic efficace et l’expression à la surface de certains récepteurs et canaux. En influençant la courbure membranaire et la dynamique de la voie de sécrétion, REEP5 affecte des processus cellulaires tels que la maturation des protéines, le transport vésiculaire et le maintien de l’homéostasie du RE. Une activité altérée de REEP5 a été associée à une perturbation de la signalisation des récepteurs et de l’organisation membranaire, ce qui en fait une protéine pertinente pour l’étude de l’excitabilité cellulaire, de l’adaptation au stress et du remodelage des voies de signalisation dans des états pathologiques. REEP5 humaine constitue donc une cible utile pour analyser la morphogenèse du RE et les mécanismes de trafic des récepteurs qui s’entrecroisent avec les réseaux de signalisation et la fitness cellulaire.

REEP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de REEP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

REEP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus REEP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription REEP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de REEP5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus REEP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de REEP5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie REEP5 dans les cellules tumorales présentant une expression de REEP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.