Plasmide CRISPR d'Activation (m) RB1CC1: sc-419502-ACT

Rb1cc1 code pour RB1CC1 (également appelé FIP200), un composant central du complexe ULK1 initiateur de l’autophagie, qui coordonne la formation des autophagosomes en fonction de l’état nutritionnel et du stress cellulaire. RB1CC1 interagit aussi avec les voies de signalisation mTOR et AMPK afin de coupler les voies de détection des facteurs de croissance et de l’énergie au flux autophagique, influençant le contrôle qualité mitochondrial et la protéostase. Par ces fonctions, RB1CC1 affecte la survie cellulaire, l’inflammation et l’homéostasie tissulaire, ce qui en fait une cible largement étudiée dans des contextes tels que les maladies neurodégénératives, la dérégulation métabolique et la biologie du cancer. Dans des modèles murins, la modulation de RB1CC1 offre un levier mécanistique pour étudier les programmes d’adaptation au stress et le remodelage dépendant de l’autophagie dans divers types cellulaires.

RB1CC1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rb1cc1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RB1CC1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rb1cc1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rb1cc1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RB1CC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rb1cc1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RB1CC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RB1CC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rb1cc1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.