Plásmido CRISPR de Activación (m) RANK: sc-423439-ACT

El gen murino Tnfrsf11a codifica RANK, un miembro de la superfamilia de receptores del TNF que funciona como un transductor central de señales para la comunicación dependiente de RANKL entre los compartimentos inmunitario, óseo y estromal. La activación de RANK recluta adaptadores TRAF para estimular las vías de señalización NF-κB, MAPK (ERK/JNK/p38) y PI3K–AKT, coordinando la diferenciación y supervivencia de los osteoclastos y los programas de expresión génica inflamatoria. In vivo e in vitro, la actividad alterada de la vía de RANK está estrechamente vinculada a una remodelación ósea desregulada y al crosstalk del microambiente inmunitario, lo que convierte a Tnfrsf11a en un nodo clave para estudiar la osteoinmunología y la homeostasis tisular. Como receptor con salidas dependientes del contexto, RANK ofrece un punto de entrada abordable para investigar redes transcripcionales aguas abajo y fenotipos celulares inducidos por ligandos.

RANK El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Tnfrsf11a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RANK El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Tnfrsf11a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Tnfrsf11a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RANK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Tnfrsf11a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RANK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RANK en células tumorales con expresión de Tnfrsf11a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.