RAMP2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402546-ACT

Das Rezeptoraktivitäts-modifizierende Protein 2 (RAMP2) ist eine membranständige Hilfsuntereinheit mit einer einzelnen Transmembranhelix, die den Transport, die Ligandenspezifität und die Signalantwort ausgewählter Klasse‑B‑GPCR‑Komplexe formt, insbesondere des Calcitoninrezeptor‑ähnlichen Rezeptors (CLR). Durch die Ermöglichung der Bildung funktioneller Adrenomedullin‑Rezeptoren moduliert RAMP2 cAMP‑getriebene Signalprogramme, die die endotheliale Homöostase, die vaskuläre Permeabilität, die Lymphgefäßbiologie und angiogene Antworten beeinflussen. RAMP2‑abhängige Signalgebung überschneidet sich mit Signalwegen, die die Zytoskelettdynamik, die über Stickstoffmonoxid gekoppelte Regulation des Gefäßtonus und entzündliches Remodeling steuern. Eine fehlregulierte Aktivität der RAMP2/CLR‑Adrenomedullin‑Achse wurde mit kardiovaskulären sowie vaskulär‑entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext endothelialer Dysfunktion und der Integrität der Barrierefunktion untersucht.

RAMP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAMP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RAMP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAMP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAMP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RAMP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAMP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RAMP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RAMP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAMP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.