Plásmido CRISPR de Activación (h) Rak: sc-405590-ACT

El FRK humano codifica Rak, una tirosina quinasa no receptora de la familia BRK que modula la señalización intracelular al fosforilar sustratos implicados en las respuestas a factores de crecimiento, la adhesión y la organización del citoesqueleto. Rak se ha implicado en la regulación de la diferenciación epitelial y del control del ciclo celular mediante vías que convergen con la señalización de receptores tirosina quinasa y con componentes posteriores de las redes MAPK/ERK y PI3K/AKT. La alteración de la expresión de FRK o del equilibrio de su señalización se ha asociado con cambios en la proliferación, la migración y las respuestas al estrés observados en múltiples contextos relevantes para la enfermedad, incluida la biología del cáncer. Como nodo en circuitos de señalización impulsados por quinasas, FRK se estudia con frecuencia para definir cómo la fosforilación de tirosinas remodela los programas transcripcionales y el estado fenotípico.

Rak El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FRK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rak El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FRK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FRK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rak. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FRK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rak en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rak en células tumorales con expresión de FRK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.