Plasmide CRISPR d'Activation (h) Raftlin: sc-406009-ACT

RFTN1 code pour Raftlin, une protéine d’échafaudage associée aux radeaux lipidiques, enrichie dans les cellules immunitaires, où elle contribue à organiser des microdomaines membranaires coordonnant la signalisation proximale des récepteurs. Raftlin participe aux voies du récepteur des cellules B et d’autres immunorécepteurs en régulant la localisation et la stabilité des complexes de signalisation au sein de radeaux riches en cholestérol, influençant ainsi des programmes transcriptionnels en aval liés à MAPK et à NF-κB. À travers ces fonctions, RFTN1 est étudié dans le contexte de l’activation immunitaire, de la dynamique de signalisation des récepteurs de l’antigène et de la régulation des réseaux inflammatoires, avec des associations rapportées à des phénotypes de maladies à médiation immunitaire et à des altérations de la fonction des cellules immunitaires. Son positionnement à proximité immédiate de la membrane en fait un nœud utile pour analyser comment l’organisation des radeaux module la transduction du signal et les réponses cellulaires.

Raftlin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RFTN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Raftlin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RFTN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RFTN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Raftlin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RFTN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Raftlin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Raftlin dans les cellules tumorales présentant une expression de RFTN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.