Rac 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400175-ACT

RAC1 kodiert die kleine Rho-Familien-GTPase Rac1, einen zentralen Regulator der Aktin-Zytoskelett-Dynamik, der die Bildung von Lamellipodien, die Zellpolarität, den Turnover von Adhäsionen und die gerichtete Migration steuert. Rac1 signalisiert über Effektoren wie PAK-Kinasen und den WAVE/Arp2/3-Komplex und integriert Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen und Integrinen, um MAPK-Signalkaskaden, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und den endozytotischen Transport zu modulieren. Über diese Signalwege beeinflusst RAC1 Proliferation, Überleben und Barrierefunktion in vielen Zelltypen. Eine fehlregulierte RAC1-Aktivität wird häufig im Kontext onkogener Signalgebung, metastaseassoziierter Zellmotilität, entzündlicher Antworten und neuroentwicklungsbezogener Phänotypen untersucht, bei denen Zytoskelett-Remodelling und synaptische Plastizität verändert sind.

Rac 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rac 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rac 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rac 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rac 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.