Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 9A: sc-416915-ACT

RAB9A code la protéine Rab9A, une petite GTPase qui régule la dynamique des endosomes tardifs et le transport rétrograde des endosomes tardifs vers le réseau trans-Golgi. En coordonnant le bourgeonnement des vésicules, leur transport et la fusion membranaire, Rab9A soutient le tri endosomal, l’homéostasie lysosomale et le recyclage de cargaisons telles que les récepteurs du mannose-6-phosphate. Cet axe de trafic recoupe les voies autophagie–lysosome ainsi que des réseaux plus larges de transport membranaire qui façonnent la protéostasie et la signalisation cellulaires. Un transport endosomal dérégulé et une activité anormale des GTPases Rab ont été associés à des mécanismes pertinents pour la neurodégénérescence, le trafic intracellulaire des agents pathogènes et la biologie des cellules cancéreuses, faisant de RAB9A un nœud utile pour des études mécanistiques.

Rab 9A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB9A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 9A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB9A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB9A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 9A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB9A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 9A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 9A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB9A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.