Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 8A: sc-404285-ACT

RAB8A code la petite GTPase Rab8A, un régulateur central du trafic membranaire post-Golgi qui coordonne l’exocytose polarisée, le bourgeonnement vésiculaire et l’arrimage lors de l’acheminement des cargos vers la membrane plasmique et le cil primaire. Rab8A agit de concert avec des GEF et des effecteurs pour contrôler la dynamique des endosomes de recyclage, la ciliogenèse et l’organisation du cytosquelette, influençant ainsi la polarité cellulaire et la migration dirigée. Par ces fonctions, RAB8A participe à des voies liées à la biologie des ciliopathies et à la signalisation du développement, et sa dérégulation a été associée, dans des contextes liés au cancer, à des programmes de sécrétion modifiés et à des comportements cellulaires invasifs. Le trafic dépendant de Rab8A s’interface également avec le transport neuronal et le remodelage membranaire lié à l’autophagie, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques dans divers tissus.

Rab 8A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB8A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 8A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB8A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB8A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 8A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB8A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 8A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 8A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB8A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.