Plásmido CRISPR de Activación (m) PYPAF7: sc-436175-ACT

El Nlrp12 (PYPAF7) de ratón codifica un receptor tipo NOD que funciona como sensor de la inmunidad innata y regulador de la señalización inflamatoria. Contribuye al control de las salidas de las vías NF-κB y MAPK aguas abajo de los receptores de reconocimiento de patrones y de citocinas, modulando la activación mieloide, la expresión de quimiocinas y el tráfico de leucocitos. A través de su papel en procesos asociados al inflamasoma y en la regulación negativa de la inflamación excesiva, la actividad alterada de Nlrp12 se ha vinculado con una homeostasis inmunitaria desregulada y con fenotipos inflamatorios en modelos experimentales de enfermedad. Estas propiedades hacen de Nlrp12 un nodo útil para estudiar puntos de control de la inmunidad innata, la inflamación sensible a la microbiota y el crosstalk de señalización que influye en la inflamación tisular.

PYPAF7 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Nlrp12 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PYPAF7 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Nlrp12 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Nlrp12, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PYPAF7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Nlrp12 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PYPAF7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PYPAF7 en células tumorales con expresión de Nlrp12 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.