Plásmido CRISPR de Activación (h) POH1: sc-405591-ACT

PSMD14 codifica POH1, una subunidad metaloproteasa JAMM/MPN+ de la partícula reguladora 19S del proteasoma humano 26S que elimina cadenas de ubiquitina unidas por K48 durante el procesamiento del sustrato. Al acoplar la desubiquitinación a la degradación proteasomal, POH1 ayuda a mantener la homeostasis proteica y modula el recambio de reguladores clave implicados en las respuestas al daño del ADN, la progresión del ciclo celular y la señalización adaptativa al estrés. La actividad de PSMD14 se integra con el control dependiente de ubiquitina de procesos asociados a la cromatina y puede influir en vías como la señalización de NF-κB mediante la degradación regulada de componentes de la vía. La desregulación de la desubiquitinación asociada al proteasoma se ha vinculado a fenotipos de proteostasis aberrante y de estabilidad genómica relevantes para la biología del cáncer y la investigación en neurodegeneración.

POH1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PSMD14 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

POH1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PSMD14 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PSMD14, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de POH1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PSMD14 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de POH1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía POH1 en células tumorales con expresión de PSMD14 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.