POD-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402890-ACT

TCF21 kodiert den basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor POD-1, einen schicksalsbestimmenden Regulator, der mesenchymale Differenzierungsprogramme und die Organentwicklung koordiniert, einschließlich epikardialer, renaler und gonadaler Stromalinien. POD-1 moduliert Transkriptionsnetzwerke, die sich mit epithelial-mesenchymalen Transitionen, dem Umbau der extrazellulären Matrix und der Kontrolle des Zellzyklus überschneiden, und zwar über kontextabhängige Interaktionen mit anderen bHLH-Faktoren und entwicklungsbiologischen Signalwegen. In adulten Geweben ist eine veränderte TCF21-Expression mit Veränderungen der Aktivierungszustände von Fibroblasten und stromalem Remodeling verknüpft und beeinflusst Genprogramme, die für die Gewebehomöostase relevant sind. Eine Fehlregulation von TCF21/POD-1 wurde mit krebsrelevanter transkriptioneller Umprogrammierung sowie fibrotischen bzw. Remodeling-Phänotypen in Verbindung gebracht, was es für die Untersuchung der Stromabiologie und differenzierungsassoziierter Gennetzwerke nützlich macht.

POD-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TCF21-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POD-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TCF21-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TCF21-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POD-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TCF21-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POD-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POD-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TCF21-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.