Plasmide CRISPR d'Activation (h) PNUTS: sc-403688-ACT

PPP1R10 code pour PNUTS (protein phosphatase 1 regulatory subunit 10), une sous-unité de ciblage nucléaire qui se lie à PP1 et module l’activité de la phosphatase sur des substrats associés à la chromatine. PNUTS participe au contrôle transcriptionnel, à la signalisation de la réponse aux dommages de l’ADN et à la progression du cycle cellulaire en coordonnant la déphosphorylation des protéines avec les voies de maintien du génome. Elle a été impliquée dans la régulation de la transcription dépendante de l’ARN polymérase II ainsi que dans des processus affectant la stabilité des télomères et le stress de réplication. Une activité altérée de PPP1R10/PNUTS a été associée à une prolifération dérégulée et à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents pour la biologie du cancer et d’autres troubles impliquant une réparation de l’ADN et une signalisation nucléaire déficientes.

PNUTS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PNUTS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PNUTS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PNUTS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PNUTS dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.