plakophilin 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402990-ACT

PKP2 kodiert Plakophilin 2, ein Armadillo-Repeat-Protein, das an Desmosomen und Glanzstreifen (interkalierte Disks) lokalisiert ist und die Zell-Zell-Adhäsion stabilisiert, indem es desmosomale Cadherine mit Zytoskelettnetzwerken verknüpft. Über Interaktionen mit Desmoplakin, Plakoglobin und Intermediärfilamenten trägt Plakophilin 2 zur Integrität der Zellkontakte, zur Mechanotransduktion und zur Gewebearchitektur bei – insbesondere in mechanisch belasteten Epithelien und Herzmuskelzellen. Die Funktion von PKP2 ist zudem mit Signalprogrammen verknüpft, die auf den Zustand der Zelladhäsion und die Spannung im Zytoskelett reagieren. Genetische und funktionelle Veränderungen in PKP2 wurden mit Phänotypen der arrhythmogenen Kardiomyopathie sowie damit verbundenen Defekten der myokardialen Erregungsleitung und des strukturellen Remodelings in Verbindung gebracht, was seine Eignung als Ziel in Studien zur Biologie kardialer Zellkontakte unterstreicht.

plakophilin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PKP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

plakophilin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PKP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PKP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen plakophilin 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PKP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von plakophilin 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des plakophilin 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PKP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.