Plásmido CRISPR de Activación (m) PKD2: sc-430381-ACT

Prkd2 codifica la proteína quinasa D2 (PKD2), una quinasa de serina/treonina de la familia PKD tipo CAMK que transmite señales aguas abajo del diacilglicerol y de la proteína quinasa C. PKD2 regula el control de la expresión génica dependiente de fosforilación, el tráfico de vesículas desde la red trans-Golgi, la remodelación del citoesqueleto y programas de supervivencia sensibles al estrés, integrando señales procedentes de GPCR y de receptores tirosina quinasa. En células de ratón, la actividad de PKD2 se ha relacionado con vías que gobiernan la activación de células inmunitarias, la señalización inflamatoria y la migración celular mediante la modulación de salidas transcripcionales asociadas a MAPK y NF-κB. La desregulación de la señalización de PKD2 se estudia en contextos como la proliferación aberrante, la remodelación tisular y los mecanismos de enfermedad inflamatoria, lo que respalda su utilidad como un nodo para la interrogación de vías.

PKD2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Prkd2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PKD2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Prkd2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Prkd2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PKD2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Prkd2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PKD2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PKD2 en células tumorales con expresión de Prkd2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.