Plasmide CRISPR d'Activation (h) PINK1: sc-400739-ACT

PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) code une sérine/thréonine kinase ciblée vers les mitochondries, qui agit comme un capteur clé des dommages mitochondriaux et comme un initiateur de la mitophagie. En cas de perte du potentiel de membrane mitochondriale, PINK1 s’accumule sur la membrane externe des mitochondries et favorise le recrutement et l’activation de PRKN/Parkin, coordonnant l’élimination, dépendante de l’ubiquitine, des organites altérés ainsi que le remodelage de la dynamique mitochondriale. Cette voie s’interface avec les réponses cellulaires au stress, notamment la signalisation du stress oxydant, la protéostase et l’activation de l’immunité innée liée au dysfonctionnement mitochondrial. Une activité altérée de PINK1 a été impliquée dans la neurodégénérescence et d’autres troubles caractérisés par un contrôle qualité mitochondrial défectueux, ce qui en fait une cible largement utilisée dans les études de l’homéostasie mitochondriale.

PINK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PINK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PINK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PINK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PINK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PINK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PINK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PINK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PINK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PINK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.