PHLPPL CRISPR Activation Plasmid (m): sc-434083-ACT

Das Mausgen *Phlpp2* kodiert PHLPPL, eine Ser/Thr-Phosphatase der PP2C-Familie, die Wachstumsfaktor-Signale abschwächt, indem sie AGC-Kinasen dephosphoryliert – insbesondere AKT an Ser473. Dadurch begrenzt sie die Stärke des PI3K–AKT-Signalwegs sowie nachgeschaltete, mTOR-gekoppelte Stoffwechsel- und Überlebensprogramme. Durch die negative Regulation der Kinase-Phosphorylierung trägt PHLPPL zur Steuerung zellulärer Entscheidungen wie Proliferation, Apoptose und Stressantworten bei und kann die Rückkopplungskontrolle innerhalb von Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalnetzwerken beeinflussen. Veränderte PHLPP/PHLPPL-Aktivität wurde in der Literatur mit einer gestörten Signalfunktion (Signalhomöostase) in Verbindung gebracht, die für onkogene Transformation, Insulin- und Energiestoffwechsel sowie entzündungsassoziierte Phänotypen relevant ist, was *Phlpp2* zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Pufferung von Signalwegen macht. Als Phosphatase, die kinasegetriebene Kaskaden ausbalanciert, ist PHLPPL zudem relevant, um Effekte der Signaldauer und Mechanismen adaptiver Resistenz in Zellmodellen zu untersuchen.

PHLPPL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Phlpp2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PHLPPL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Phlpp2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Phlpp2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PHLPPL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Phlpp2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PHLPPL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PHLPPL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Phlpp2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.