PH-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409966-ACT

Humanes P4HTM kodiert PH-4, eine mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziierte Prolyl-4-Hydroxylase, die die Hydroxylierung von Prolinresten in Protein-Substraten katalysiert. Diese posttranslationale Modifikation kann die Proteinfaltung, -stabilität und -sekretion beeinflussen. Als Teil des umfassenderen Netzwerks der Prolyl-Hydroxylasen verknüpft PH-4 eine von Sauerstoff- und Metaboliten abhängige enzymatische Aktivität mit der Proteostase sowie zellulären Adaptationswegen. Eine dysregulierte Hydroxylierungschemie und ER-Prozessierung wurden mit veränderter Stresssignalgebung und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was das Interesse an P4HTM als Knotenpunkt stützt, der Redoxzustand, Proteinkontrolle und die Regulation von Zellzuständen verbindet. Genetische Variation und Expressionsänderungen in P4HTM wurden in Zusammenhängen untersucht, die metabolische und neuroentwicklungsbezogene Merkmale betreffen, was mechanistische Studien in relevanten menschlichen Zellmodellen motiviert.

PH-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P4HTM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PH-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P4HTM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P4HTM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PH-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P4HTM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PH-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PH-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P4HTM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.