Plasmide CRISPR d'Activation (h) Peroxin 14: sc-405075-ACT

PEX14 code la péroxine 14, un composant essentiel de la machinerie d’import peroxysomale, qui ancre les complexes récepteurs PEX5/PEX7 à la membrane du peroxysome afin de permettre la translocation des enzymes de la matrice. Par son rôle dans la biogenèse des peroxysomes et l’import des protéines, PEX14 soutient la β‑oxydation des acides gras, la synthèse des lipides éther et la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, ce qui le relie à l’équilibre redox cellulaire et à l’homéostasie lipidique. Des altérations de l’import et de la biogenèse peroxysomaux sont associées aux troubles de la biogenèse des peroxysomes ainsi qu’à des phénotypes métaboliques et neurodéveloppementaux plus larges, ce qui fait de la régulation de PEX14 un sujet pertinent pour des études mécanistiques du dysfonctionnement des organites. Dans des modèles de cellules humaines, la modulation de PEX14 constitue un point d’entrée pratique pour étudier les voies dépendantes des peroxysomes et leurs interactions avec la signalisation mitochondriale et inflammatoire.

Peroxin 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PEX14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Peroxin 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PEX14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PEX14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Peroxin 14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PEX14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Peroxin 14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Peroxin 14 dans les cellules tumorales présentant une expression de PEX14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.