Plasmide CRISPR d'Activation (h) periplakin: sc-402350-ACT

Le gène humain **PPL** code la périplakine, une protéine de liaison cytosquelettique de la famille des plakines qui relie les filaments intermédiaires aux desmosomes et à l’enveloppe cornée, contribuant à la stabilité mécanique des épithéliums et des endothéliums. La périplakine participe à l’assemblage des desmosomes, à l’organisation du réseau de kératines et au remodelage du cytosquelette lors de la différenciation et des réponses aux lésions, et peut moduler des voies de signalisation associées à l’adhérence cellulaire et aux réponses au stress. Des altérations de l’expression ou de la localisation de **PPL** ont été rapportées dans de nombreuses pathologies épithéliales, notamment des dermatoses inflammatoires et des cancers, où l’intégrité des jonctions cellule–cellule et le comportement migratoire sont concernés. En tant que plateforme d’assemblage à la périphérie cellulaire, la périplakine est fréquemment étudiée dans la formation de la barrière, la polarité épithéliale et la régulation, dépendante des jonctions, de la prolifération et de l’invasion.

periplakin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

periplakin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de periplakin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de periplakin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie periplakin dans les cellules tumorales présentant une expression de PPL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.