PCTAIRE-3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422147-ACT

Cdk18 kodiert die Serin/Threonin-Kinase PCTAIRE-3, ein Mitglied der cyclinabhängigen Kinase-verwandten Familie, die an der Koordination zellzyklusassoziierter Signalwege mit Prozessen des Zytoskeletts und des Membrantransports beteiligt ist. In Mauszellen wurde die Aktivität von PCTAIRE-3 mit der Regulation von Zellproliferation, Differenzierungsprogrammen und stressresponsiven Signalknoten in Verbindung gebracht, die Kinasekaskaden mit transkriptionellen Outputs verknüpfen. Wie bei anderen atypischen CDKs können veränderte Expression oder ein veränderter Signalgebungskontext Signalwege beeinflussen, die für die Gewebehomöostase, die neuronale oder Keimbahnentwicklung sowie onkogene Phänotypen relevant sind – unter anderem über Effekte auf Checkpoint-Kontrolle und Zellüberleben. Diese Eigenschaften machen Cdk18 zu einem nützlichen Ziel, um die Verschaltung von Kinasenetzwerken und die kontextabhängige Regulation von Wachstum und Differenzierung zu untersuchen.

PCTAIRE-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cdk18-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCTAIRE-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cdk18-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cdk18-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCTAIRE-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cdk18-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCTAIRE-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCTAIRE-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cdk18-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.