Plasmide CRISPR d'Activation (m) PBEF: sc-425569-ACT

Nampt chez la souris code PBEF (également appelée visfatine), une enzyme limitante de la voie de sauvetage du NAD⁺ qui convertit la nicotinamide en nicotinamide mononucléotide, soutenant ainsi le métabolisme énergétique cellulaire et l’homéostasie rédox. En contrôlant la disponibilité du NAD⁺, PBEF influence les voies de signalisation dépendantes des sirtuines et des PARP, la fonction mitochondriale, la capacité de réparation de l’ADN et les réponses au stress. L’activité Nampt/PBEF est étroitement liée à la régulation immunométabolique, à la signalisation inflammatoire et aux programmes de survie cellulaire qui modulent les réponses en situation de dysfonctionnement métabolique et d’adaptation métabolique associée aux tumeurs. Un métabolisme du NAD⁺ dérégulé impliquant Nampt a été étudié dans des contextes incluant la résistance à l’insuline, le stress bioénergétique pertinent pour la neurodégénérescence et des modèles de maladies prolifératives où la demande en NAD⁺ est élevée.

PBEF Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Nampt sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PBEF Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Nampt dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Nampt, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PBEF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Nampt natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PBEF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PBEF dans les cellules tumorales présentant une expression de Nampt silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.