paxillin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422546-ACT

Mouse Pxn kodiert Paxillin, einen Adapter der Fokalkontakte, der Integrin-Signale mit dem Umbau des Aktin-Zytoskeletts koordiniert und dadurch Zelladhäsion, Ausbreitung und gerichtete Migration reguliert. Paxillin fungiert an Adhäsionsstellen als Gerüstprotein für Kinasen und Regulatoren von GTPasen und verknüpft Signale aus der extrazellulären Matrix mit Signalwegen wie FAK/Src, PI3K–AKT und der Rho-Familie, die Traktionskräfte und Mechanotransduktion steuern. Über diese Netzwerke beeinflusst Paxillin Proliferation, Überleben sowie epithelial–mesenchymale Dynamiken und ist damit relevant für Studien zu invasivem Zellverhalten und Gewebeumbau. Eine fehlregulierte Paxillin-Signalgebung und ein veränderter Umsatz von Fokalkontakten werden häufig in Modellen der Krebsprogression, Wundheilung und inflammatorischer Mikroumgebungen untersucht.

paxillin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pxn-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

paxillin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pxn-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pxn-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen paxillin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pxn-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von paxillin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des paxillin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pxn-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.