Plasmide CRISPR d'Activation (h) PARG: sc-404382-ACT

La glycohydrolase du poly(ADP-ribose) (PARG) est la principale enzyme responsable de l’hydrolyse des chaînes de poly(ADP-ribose) (PAR) synthétisées par les membres de la famille PARP, mettant ainsi fin à la signalisation de la PARylation et restaurant la fonction des protéines après des réponses au stress. En régulant le renouvellement du PAR, PARG contribue au contrôle de la détection et de la réparation des dommages à l’ADN, du remodelage de la chromatine, de la tolérance au stress de réplication et des voies de mort cellulaire telles que la parthanatose, via la modulation du recrutement de protéines dépendant du PAR. L’activité de PARG est liée aux processus de réparation par excision de base et de réparation des cassures simple brin, influençant la stabilité du génome et les programmes transcriptionnels associés à l’adaptation cellulaire au stress. Une dérégulation du métabolisme du PAR a été associée à la biologie des cancers et aux maladies neurodégénératives, faisant de PARG un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la capacité de réparation de l’ADN, de la dynamique de la chromatine et de la signalisation induite par le stress.

PARG Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PARG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PARG Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PARG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PARG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PARG. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PARG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PARG au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PARG dans les cellules tumorales présentant une expression de PARG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.