Paraxis CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403926-ACT

Humanes TCF15 kodiert Paraxis, einen basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor, der während der Embryogenese die Musterbildung des paraxialen Mesoderms und die Kompartimentierung der Somiten steuert. Paraxis reguliert Linienprogramme, die die myogene und chondrogene Differenzierung bestimmen, und koordiniert Transkriptionsnetzwerke, die an Epithelialisierung, Zellschicksalsfestlegung und Gewebemorphogenese beteiligt sind. Aufgrund seiner Rolle in der entwicklungsbiologischen Genregulation wird TCF15 in Signalwegen untersucht, die die muskuloskelettale Entwicklung prägen, sowie in Modellen aberranter Differenzierungszustände, die für angeborene Entwicklungsdefekte und krebsassoziierte transkriptionelle Reprogrammierung relevant sind. Eine dysregulierte TCF15-Expression wurde in mehreren Tumorkontexten beschrieben, was seinen Einsatz als Knotenpunkt zur Analyse kontextspezifischer transkriptioneller Kontrolle und von Übergängen der Zellidentität motiviert.

Paraxis Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TCF15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Paraxis Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TCF15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TCF15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Paraxis-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TCF15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Paraxis-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Paraxis-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TCF15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.