Plásmido CRISPR de Activación (h) P2Y1: sc-401759-ACT

P2RY1 codifica el receptor humano P2Y1, un receptor purinérgico acoplado a proteína G que se activa principalmente por el ADP extracelular. P2Y1 se acopla a la señalización Gq/11 para estimular la fosfolipasa C, elevar el Ca2+ intracelular y activar vías dependientes de PKC que modulan la activación plaquetaria, el tono vascular y respuestas secretoras en múltiples tipos celulares. En los sistemas nervioso e inmunitario, P2Y1 contribuye a la señalización neuromoduladora e inflamatoria mediante una comunicación cruzada coordinada con otros receptores purinérgicos y efectores posteriores dependientes de MAPK y del calcio. La señalización purinérgica desregulada que involucra a P2Y1 se ha estudiado en contextos que incluyen la biología relacionada con la trombosis, la homeostasis cardiovascular y fenotipos asociados a la neuroinflamación.

P2Y1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de P2RY1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

P2Y1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus P2RY1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional P2RY1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de P2Y1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo P2RY1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de P2Y1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía P2Y1 en células tumorales con expresión de P2RY1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.