P2X3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402380-ACT

Das humane P2RX3-Gen kodiert den P2X3-Rezeptor, einen ATP-gesteuerten Kationenkanal, der in peripheren sensorischen Neuronen stark angereichert ist und dort als Antwort auf extrazelluläre Nukleotide schnelle depolarisierende Ströme sowie einen Calciumeinstrom vermittelt. P2X3 ist an der purinergen Neurotransmission beteiligt und integriert Entzündungs- und Gewebeschädigungssignale, indem es die Freisetzung von extrazellulärem ATP mit neuronaler Erregbarkeit, neurogener Entzündung und synaptischer Kommunikation in sensorischen Bahnen verknüpft. Eine fehlregulierte P2X3-Signalübertragung wurde mit veränderter nozizeptiver Verarbeitung und Phänotypen sensorischer Überempfindlichkeit in Verbindung gebracht, was P2RX3 zu einem geeigneten Ziel für die Untersuchung stimulusinduzierter neuronaler Aktivierung und schmerzbezogener Schaltkreis-Mechanismen macht. Diese Biologie ist auch für breitere Netzwerke der Ionenkanal-Signalisierung und GPCR-nahen Signalwege relevant, die auf MAPK, calciumabhängige Transkription und eine zytokinvermittelte Modulation der Funktion sensorischer Neuronen zusammenlaufen.

P2X3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P2RX3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

P2X3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P2RX3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P2RX3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen P2X3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P2RX3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von P2X3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des P2X3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P2RX3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.