Plasmide CRISPR d'Activation (h) P/Q-type Ca⁺⁺ CP α1A: sc-404267-ACT

CACNA1A code la sous-unité α1A formant le pore des canaux calciques voltage-dépendants de type P/Q (CaV2.1), qui assurent une entrée de Ca²⁺ activée à haut seuil dans les cellules excitables. Dans les neurones, CaV2.1 est enrichi au niveau des zones actives présynaptiques, où il couple la dépolarisation membranaire à la fusion des vésicules synaptiques dépendante du Ca²⁺, modulant ainsi la probabilité de libération des neurotransmetteurs, la plasticité à court terme et l’excitabilité des réseaux. L’activité du canal s’intègre à des voies de signalisation régulées par le Ca²⁺, notamment la modulation dépendante de la calmoduline, la phosphorylation par la PKA/PKC et des programmes transcriptionnels en aval sensibles à la dynamique du Ca²⁺ intracellulaire. Les variations génétiques ou la dérégulation de CACNA1A sont associées à des phénotypes neurologiques impliquant les circuits cérébelleux et corticaux, ce qui étaye son utilisation dans des études de physiologie synaptique et de mécanismes du neurodéveloppement.

P/Q-type Ca++ CP α1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P/Q-type Ca++ CP α1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P/Q-type Ca++ CP α1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P/Q-type Ca++ CP α1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P/Q-type Ca++ CP α1A dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.