Ob CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400706-ACT

Das humane LEP kodiert das Adipokin Leptin (Ob), einen zentralen endokrinen Regulator der Energiebilanz, der den Nährstoffstatus des Fettgewebes an den Hypothalamus vermittelt, um Appetit und Energieverbrauch zu modulieren. Die Leptin-Signalübertragung erfolgt hauptsächlich über eine durch LEPR vermittelte Aktivierung von JAK2/STAT3 und überschneidet sich mit den PI3K–AKT- und MAPK-Signalwegen, wodurch die Glukosehomöostase, der Lipidstoffwechsel und neuroendokrine Funktionen beeinflusst werden. In peripheren Geweben prägt Leptin zudem Immun- und Entzündungsprozesse und verknüpft den metabolischen Zustand mit der Zytokinsignalgebung und der Aktivität von Immunzellen. Eine dysregulierte LEP-Expression oder Leptinresistenz ist mit adipositasassoziierten metabolischen Phänotypen sowie umfassenderer kardiometabolischer und entzündlicher Krankheitsbiologie verbunden, was LEP zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien macht.

Ob Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LEP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ob Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LEP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LEP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ob-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LEP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ob-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ob-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LEP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.