NUDT8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425987-ACT

Mouse Nudt8 kodiert NUDT8, ein Mitglied der Nudix-Hydrolase-Familie, das die Hydrolyse von Nukleosiddiphosphat-Derivaten katalysiert, um die Qualität des Nukleotidpools aufrechtzuerhalten und die Anreicherung potenziell toxischer Metaboliten zu begrenzen. Durch die Kontrolle der Spiegel oxidierter oder aberranter Nukleotidspezies trägt NUDT8 zur metabolischen Homöostase bei und hilft, Nukleinsäuren vor Fehlinkorporation und Schäden zu schützen. Nudix-Enzyme werden häufig mit zellulären Stressantworten, Redoxgleichgewicht sowie der Integrität von DNA/RNA in Verbindung gebracht, wodurch Expression und Regulation von Nudt8 für Studien zur Genomstabilität und zu entzündungsassoziierten Signalwegen relevant sind. Veränderte Mechanismen der „Nukleotid-Sanitation“ werden oft im Kontext von Krebsbiologie, Neurodegeneration und metabolischer Dysregulation untersucht, da Änderungen im Nukleotidumsatz die Mutationslast und Programme des Zellüberlebens beeinflussen können.

NUDT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nudt8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NUDT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nudt8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nudt8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NUDT8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nudt8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NUDT8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NUDT8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nudt8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.