Plásmido CRISPR de Activación (m) Notch1: sc-421930-ACT

El gen Notch1 de ratón codifica un receptor transmembrana de paso único que media la señalización canónica de Notch para controlar decisiones de destino celular, proliferación y diferenciación en múltiples tejidos. La unión del ligando desencadena un corte proteolítico y la translocación nuclear del dominio intracelular de Notch, que se asocia con RBPJ para regular programas transcripcionales como los genes diana de las familias Hes y Hey. La actividad de Notch1 se interconecta con vías que gobiernan el mantenimiento de células madre y progenitoras, la dinámica epitelio‑mesénquima y la especificación de linajes inmunitarios. La señalización desregulada de Notch1 se utiliza ampliamente como modelo mecanístico en defectos del desarrollo y procesos asociados a enfermedad, incluidos la diferenciación aberrante y la reprogramación oncogénica de la transcripción.

Notch1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Notch1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Notch1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Notch1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Notch1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Notch1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Notch1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Notch1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Notch1 en células tumorales con expresión de Notch1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.