NNT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402908-ACT

Humanes NNT (Nicotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase) ist ein Enzym der inneren Mitochondrienmembran, das die protonenmotorische Kraft mit dem Transfer von Reduktionsäquivalenten zwischen NAD(H) und NADP(H) koppelt und so die mitochondrialen NADPH-Pools aufrechterhält. Durch die Unterstützung glutathion- und thioredoxinabhängiger antioxidativer Systeme trägt NNT zur Kontrolle reaktiver Sauerstoffspezies bei und bewahrt die Redoxhomöostase während der oxidativen Phosphorylierung und bei metabolischem Stress. Die NNT-Aktivität beeinflusst die mitochondriale Atmung, die Steroidogenese und weitere metabolische Signalwege über ihre Wirkung auf NADPH-abhängige Biosynthese- und Detoxifikationspfade. Störungen der NNT-Funktion wurden mit einem mitochondrialen Redox-Ungleichgewicht in Verbindung gebracht und in Kontexten wie metabolischer Dysfunktion sowie Erkrankungen mit eingeschränkter Pufferung von oxidativem Stress untersucht.

NNT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NNT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NNT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NNT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NNT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NNT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NNT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NNT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NNT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NNT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.