NNMT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403192-ACT

Humanes NNMT (Nicotinamid-N-Methyltransferase) ist eine zytosolische Methyltransferase, die die N‑Methylierung von Nicotinamid und verwandten Pyridinen unter Verwendung von S‑Adenosyl‑L‑Methionin katalysiert und damit den Xenobiotika‑Stoffwechsel mit der Homöostase von Methylgruppendonoren verknüpft. Durch die Beeinflussung des SAM/SAH‑Gleichgewichts sowie des Nicotinamid-/NAD⁺‑bezogenen metabolischen Flusses kann NNMT die epigenetische Methylierungskapazität und den übergeordneten Stoffwechselzustand modulieren. Eine veränderte NNMT‑Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten mit metabolischer Reprogrammierung sowie Veränderungen der zellulären Differenzierung und Stressantworten in Verbindung gebracht, was NNMT zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Kopplung zwischen Stoffwechsel und Epigenom macht. Entsprechend wird NNMT häufig in Signalwegen untersucht, die mit dem Ein‑Kohlenstoff‑Stoffwechsel, der Redoxregulation und der transkriptionellen Kontrolle zusammenhängen.

NNMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NNMT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NNMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NNMT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NNMT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NNMT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NNMT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NNMT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NNMT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NNMT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.