NKLAM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409031-ACT

Das humane RNF19B kodiert NKLAM, eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Ubiquitinierung von Substraten und die proteasomenabhängige Regulation immun- und stressantwortbezogener Proteine fördert. Die NKLAM-Aktivität wurde mit Effektorfunktionen der angeborenen Immunität in Verbindung gebracht, darunter die Modulation antimikrobieller Antworten, der Zytokinsignalgebung und zellulärer Aktivierungsprogramme durch eine ubiquitinvermittelte Kontrolle von Signalkomponenten. Indem RNF19B den Proteinumsatz und die Signalstärke mitprägt, ist es an Signalwegen beteiligt, die Entzündungen, Wirt–Pathogen-Interaktionen und Entscheidungen über das Zellschicksal beeinflussen. Eine veränderte Regulation von Ubiquitinierungsnetzwerken unter Beteiligung von NKLAM ist daher für Studien zur Immundysregulation und zu entzündungsassoziierten Krankheitsmechanismen relevant.

NKLAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF19B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NKLAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF19B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF19B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NKLAM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF19B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NKLAM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NKLAM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF19B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.