NKLAM CRISPR Activationプラスミド (h): sc-409031-ACT

ヒトRNF19Bは、基質のユビキチン化を促進し、プロテアソーム依存的に免疫・ストレス応答性タンパク質の制御に関与するRING型E3ユビキチンリガーゼであるNKLAMをコードする。NKLAMの活性は、シグナル伝達構成要素をユビキチン介在的に制御することで、抗菌応答、サイトカインシグナル伝達、細胞活性化プログラムの調節など、自然免疫のエフェクター機能と関連づけられている。タンパク質のターンオーバーとシグナルの強度（振幅）を形作ることにより、RNF19Bは炎症、宿主—病原体相互作用、ならびに細胞運命決定に影響する経路に関与する。したがって、NKLAMを含むユビキチン化ネットワークの制御異常は、免疫制御異常や炎症関連疾患の機序を研究するうえで重要である。

NKLAM CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RNF19Bの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

NKLAM CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RNF19B 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRNF19B転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性NKLAMの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRNF19B遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるNKLAM依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRNF19B発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるNKLAM経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。