Plásmido CRISPR de Activación (m) NKCC1: sc-422971-ACT

El gen murino **Slc12a2** codifica **NKCC1 (SLC12A2)**, un cotransportador electroneutro de **Na⁺-K⁺-2Cl⁻** que regula la homeostasis intracelular del cloruro, el control del volumen celular y la secreción de líquidos en epitelios. Al establecer los niveles citosólicos de **Cl⁻**, NKCC1 influye en la excitabilidad de la membrana y en la neurotransmisión inhibitoria mediante interacciones con la señalización GABAérgica y redes más amplias de transporte iónico. La actividad de NKCC1 contribuye a las respuestas al estrés osmótico y al movimiento transepitelial de sales en epitelios secretores, lo que la vincula a procesos fisiológicos del sistema nervioso, el pulmón y el tracto gastrointestinal. La desregulación del transporte de cloruro dependiente de NKCC1 se ha asociado con modelos de hiperexcitabilidad neurológica y con fenotipos inflamatorios de las vías respiratorias y del intestino, lo que respalda estudios mecanísticos del equilibrio iónico en contextos relevantes para la enfermedad.

NKCC1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Slc12a2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NKCC1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Slc12a2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Slc12a2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NKCC1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Slc12a2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NKCC1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NKCC1 en células tumorales con expresión de Slc12a2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.