Nix CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419357-ACT

Bnip3l (Nix) ist ein Protein der äußeren Mitochondrienmembran, das als selektiver Autophagie-Rezeptor fungiert und über sein LIR-Motiv geschädigte Mitochondrien mit LC3-positiven Autophagosomen verknüpft. In Mauszellen ist Nix an der Qualitätskontrolle von Mitochondrien, an apoptoseassoziierten Signalwegen und an hypoxieabhängigen Signalwegen beteiligt und integriert dabei Signale, die den oxidativen Stoffwechsel und das zelluläre Überleben beeinflussen. Es ist besonders bekannt für seine Rolle in der programmierten Mitophagie während der erythroiden Reifung sowie für die Regulation des mitochondrialen Umsatzes in metabolisch gestressten Geweben. Eine fehlregulierte BNIP3L/Nix-Aktivität wurde in experimentellen Modellen mit Veränderungen der mitochondrialen Homöostase und zellulären Schicksalsentscheidungen in Zusammenhang gebracht, die für Neurodegeneration, kardiale Stressantworten und die Krebsbiologie relevant sind.

Nix Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bnip3l-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nix Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bnip3l-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bnip3l-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nix-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bnip3l-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nix-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nix-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bnip3l-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.