Plasmide CRISPR d'Activation (h) NIRF: sc-403908-ACT

UHRF2 code pour NIRF, une protéine nucléaire multidomaine qui associe une activité de ligase E3 ubiquitine à la reconnaissance de l’ADN méthylé et des marques d’histones afin de coordonner la régulation épigénétique. Par l’intermédiaire de ses domaines de type ubiquitine, PHD et RING, NIRF contribue au remodelage de la chromatine, au maintien de la méthylation de l’ADN et au contrôle, lié au cycle cellulaire, de programmes transcriptionnels. Ces fonctions relient UHRF2 à des voies qui gouvernent la stabilité du génome, les réponses aux dommages de l’ADN et le contrôle de la prolifération, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des états épigénétiques aberrants dans le cancer et d’autres troubles impliquant une dérégulation de la chromatine. Une activité altérée de UHRF2/NIRF a été associée à des modifications des profils de méthylation des promoteurs ainsi qu’au silence transcriptionnel ou, au contraire, à l’activation de gènes impliqués dans la transformation oncogénique et la différenciation.

NIRF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UHRF2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NIRF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UHRF2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UHRF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NIRF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UHRF2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NIRF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NIRF dans les cellules tumorales présentant une expression de UHRF2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.