Plasmide CRISPR d'Activation (h) NIPBL: sc-403371-ACT

NIPBL code un facteur de chargement de la cohésine, essentiel à l’établissement et au maintien de la cohésion des chromatides sœurs ainsi qu’à l’organisation du génome à un niveau supérieur. En régulant la dynamique de la cohésine sur la chromatine, NIPBL influence la réplication de l’ADN, les réponses aux dommages de l’ADN et la communication à longue distance entre enhancers et promoteurs, qui façonne des programmes transcriptionnels spécifiques de lignée. L’altération de la fonction de NIPBL est fortement associée à une dérégulation des gènes du développement et constitue une cause génétique majeure du syndrome de Cornelia de Lange, ce qui en fait un nœud clé pour l’étude des mécanismes de contrôle transcriptionnel. Son rôle dans l’architecture de la chromatine relie également NIPBL à des voies qui régissent la progression du cycle cellulaire et la stabilité du génome dans les cellules humaines.

NIPBL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NIPBL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NIPBL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NIPBL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NIPBL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NIPBL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NIPBL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NIPBL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NIPBL dans les cellules tumorales présentant une expression de NIPBL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.