Plasmide CRISPR d'Activation (h) nicastrin: sc-402790-ACT

Le gène humain **NCSTN** code la nicastrine, une glycoprotéine transmembranaire de type I qui constitue une sous-unité essentielle du complexe **γ‑sécrétase**, en soutenant la reconnaissance des substrats et la maturation des assemblages protéasiques contenant la préséniline. Par l’activité de la γ‑sécrétase, la nicastrine contribue à la protéolyse intramembranaire régulée d’une grande diversité de substrats, notamment les récepteurs **NOTCH** et la protéine précurseur de l’amyloïde, reliant ainsi **NCSTN** à la signalisation Notch, aux décisions de destinée cellulaire et au renouvellement des protéines membranaires. La perturbation des composants de la γ‑sécrétase peut modifier les programmes de différenciation, la signalisation inflammatoire et la protéostasie, ce qui fait de **NCSTN** un nœud largement étudié dans des voies pertinentes pour la neurobiologie, l’homéostasie épithéliale et la biologie cutanée. La dérégulation de **NCSTN** et certaines variantes ont été associées à des affections impliquant une activité aberrante de la voie Notch et des réponses épidermiques ou immunitaires altérées, fournissant un contexte mécanistique aux études de génomique fonctionnelle.

nicastrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCSTN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nicastrin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCSTN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCSTN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nicastrin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCSTN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nicastrin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nicastrin dans les cellules tumorales présentant une expression de NCSTN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.