Plasmide CRISPR d'Activation (h) NHE-3: sc-401420-ACT

SLC9A3 code l’échangeur apical Na+/H+ NHE‑3, un régulateur majeur de l’absorption électroneutre du sodium et de l’homéostasie du pH intracellulaire dans les cellules épithéliales. L’activité de NHE‑3 s’intègre à des réseaux de transport ionique qui coordonnent l’équilibre hydrique, la gestion du bicarbonate et la fonction des microvillosités, et elle est contrôlée de façon dynamique par le trafic membranaire et la phosphorylation en aval des voies cAMP/PKA, PKC, ainsi que via des complexes d’échafaudage associés à NHERF/ezrine. Dans l’intestin et le rein, NHE‑3 contribue à coupler l’entrée de sodium aux processus de transport des nutriments et à la régulation acido‑basique, modulant ainsi le mouvement transépithélial de NaCl et de l’eau. Des altérations de l’expression ou de la régulation de SLC9A3 ont été associées à des dysfonctionnements du transport épithélial pertinents pour des phénotypes de diarrhée/constipation, des contextes de signalisation inflammatoire et des perturbations de la gestion rénale du sel.

NHE-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC9A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NHE-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC9A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC9A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NHE-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC9A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NHE-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NHE-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC9A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.