neuroglobin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401696-ACT

Das humane NGB kodiert Neuroglobin, ein sauerstoffbindendes Globin, das in Neuronen angereichert ist und die zelluläre Anpassung an Hypoxie und oxidativen Stress unterstützt. Neuroglobin wird mit der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion und der Redox-Homöostase in Verbindung gebracht; beschrieben sind unter anderem Rollen bei der Modulation des Umgangs mit reaktiven Sauerstoffspezies und bei der NO-abhängigen Signalübertragung. Über diese Prozesse verknüpft NGB die Sauerstoffverfügbarkeit mit dem neuronalen Stoffwechsel sowie Stressantwort‑Signalwegen, die das Überleben unter ischämischen oder entzündlichen Bedingungen beeinflussen. Eine veränderte Neuroglobin-Expression wurde in Modellen der Neurodegeneration und zerebrovaskulärer Schädigung mit einer erhöhten Anfälligkeit assoziiert, was NGB zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur neuronalen Resilienz macht.

neuroglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NGB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

neuroglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NGB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NGB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen neuroglobin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NGB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von neuroglobin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des neuroglobin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NGB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.