NEDD8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417924-ACT

NEDD8 kodiert das ubiquitinähnliche Protein NEDD8, einen zentralen Modifikator im Neddylierungsweg, der kovalent an Cullin-Scaffold-Proteine konjugiert wird, um Cullin–RING-E3-Ubiquitin-Ligasen (CRLs) zu aktivieren. Durch die Regulation der CRL-abhängigen Ubiquitinierung beeinflusst NEDD8 die Proteostase, die Zellzyklusprogression, die DNA-Replikation und -Reparatur sowie die Stressantwort-Signalübertragung. Die NEDD8-abhängige CRL-Aktivität steuert den Umsatz vieler kurzlebiger Regulatoren und verknüpft die Neddylierung damit mit der Checkpoint-Kontrolle und transkriptionellen Programmen. Fehlregulierte Neddylierung und eine veränderte CRL-Funktion werden häufig im Zusammenhang mit proliferativen und proteotoxischen Phänotypen, Genominstabilität und Signalweg-Remodelling untersucht, wie es in vielfältigen Krankheitsmodellen beobachtet wird.

NEDD8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NEDD8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NEDD8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NEDD8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NEDD8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NEDD8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NEDD8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NEDD8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NEDD8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NEDD8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.