Plasmide CRISPR d'Activation (h) N-Myc: sc-400253-ACT

MYCN code le facteur de transcription humain N-Myc, une protéine basique à fermeture éclair leucine de type hélice–boucle–hélice (bHLH-LZ) qui s’hétérodimérise avec MAX pour se lier aux éléments régulateurs E-box et coordonner de vastes programmes d’expression génique. N-Myc contribue à réguler la progression du cycle cellulaire, la biogenèse des ribosomes, le métabolisme, les réponses au stress de réplication de l’ADN et l’état de différenciation, via son intégration à l’activité du réseau MYC/MAX et le recrutement de cofacteurs associés à la chromatine. Une expression dérégulée de MYCN est associée à des modifications de la capacité proliférative et des programmes de lignée dans de multiples contextes tumoraux, ce qui en fait un nœud largement utilisé pour étudier les circuits transcriptionnels oncogéniques. Ses effets en aval sur la transcription par l’ARN polymérase II, l’accessibilité de la chromatine et les voies de signalisation des facteurs de croissance fournissent des mesures quantifiables pour la recherche mécanistique.

N-Myc Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MYCN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

N-Myc Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MYCN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MYCN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de N-Myc. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MYCN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de N-Myc au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie N-Myc dans les cellules tumorales présentant une expression de MYCN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.