myotubularin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403912-ACT

MTM1 codifica a miotubularina, uma fosfatase lipídica que desfosforila o fosfatidilinositol 3-fosfato e o fosfatidilinositol (3,5)-bisfosfato, regulando assim a sinalização por fosfoinositídeos em compartimentos endossomais e de tráfego de membranas. Ao controlar a endocitose, a dinâmica de membranas relacionada à autofagia e a organização do citoesqueleto, a miotubularina ajuda a manter a arquitetura celular e a homeostase das organelas. No músculo esquelético, a atividade de MTM1 está intimamente ligada a vias de remodelamento de membrana necessárias para a integridade das fibras musculares e para o suporte do acoplamento excitação–contração. Variantes com perda de função em MTM1 estão associadas à miopatia miotubular ligada ao X, o que motiva estudos mecanísticos sobre o turnover de fosfoinositídeos e a biologia das células musculares.

myotubularin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTM1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

myotubularin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTM1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTM1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de myotubularin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTM1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de myotubularin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via myotubularin em células tumorais com expressão de MTM1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.