Mucin 5B/MUC5B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401077-ACT

MUC5B codifica la mucina 5B, una mucina ad alto peso molecolare in grado di formare gel, fortemente O-glicosilata e secreta per costituire la barriera mucosa viscoelastica nelle vie aeree e in altri epiteli mucosali. MUC5B contribuisce alla clearance mucociliare regolando l’idratazione del muco, la reticolazione dei polimeri e l’intrappolamento dei patogeni, integrandosi con i programmi di differenziazione epiteliale e con la segnalazione infiammatoria che rimodellano l’ambiente di superficie extracellulare. La sua espressione è influenzata da vie guidate da citochine e dai processi secretori del RE/Golgi che coordinano la biosintesi e l’esportazione delle mucine. Livelli deregolati di MUC5B e alterazioni della reologia del muco sono ampiamente studiati nell’infiammazione cronica delle vie aeree e nella biologia della fibrosi polmonare, rendendolo un bersaglio comune per la modellizzazione meccanicistica dell’omeostasi epiteliale.

Mucin 5B/MUC5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MUC5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mucin 5B/MUC5B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MUC5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MUC5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mucin 5B/MUC5B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MUC5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mucin 5B/MUC5B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mucin 5B/MUC5B nelle cellule tumorali con espressione di MUC5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.