mtTFA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401208-ACT

TFAM kodiert den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (mtTFA), ein DNA-bindendes Protein der High-Mobility-Group, das die mitochondriale DNA (mtDNA) zu Nucleoiden verpackt und die mtDNA-Replikation sowie -Transkription koordiniert. mtTFA ist zentral für die mitochondriale Biogenese, die Kapazität der oxidativen Phosphorylierung und die Aufrechterhaltung der Integrität des mitochondrialen Genoms, indem es die mtDNA-Kopienzahl und die Zugänglichkeit von Promotoren reguliert. Eine Störung der TFAM-Expression wird mit veränderter Atmung, verstärkter mitochondrialer Stresssignalgebung und einer weitreichenden metabolischen Umprogrammierung in Verbindung gebracht, was TFAM für Studien zu Neurodegeneration, kardiometabolischen Funktionsstörungen und krebsassoziiertem mitochondrialem Remodeling relevant macht. Als zentraler Knotenpunkt der Kommunikation zwischen Mitochondrien und Zellkern wird TFAM häufig genutzt, um retrograde Signalwege, die Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies und die Anfälligkeit für Apoptose zu untersuchen.

mtTFA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TFAM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mtTFA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TFAM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TFAM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mtTFA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TFAM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mtTFA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mtTFA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TFAM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.