mTOR CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425273-ACT

Mtor kodiert die Serin/Threonin-Kinase mTOR, einen zentralen Integrator von Nährstoff-, Energie- und Wachstumsfaktorsignalen, der Zellwachstum, Stoffwechsel und Überleben koordiniert. mTOR wirkt in den Komplexen mTORC1 und mTORC2 und reguliert über Effektoren wie S6K und 4E-BP1 die Proteinsynthese, Autophagie, Lipidbiosynthese, Zytoskelettorganisation sowie die Insulin-/PI3K–AKT-Signalübertragung. In Mausmodellen wird eine veränderte Aktivität des mTOR-Signalwegs häufig genutzt, um eine fehlregulierte Wachstumskontrolle und metabolische Umprogrammierung zu untersuchen, mit Relevanz für Krebsbiologie, Neurobiologie und die Funktion von Immunzellen. Da mTOR Umweltreize mit anabolen und katabolen Programmen verknüpft, ist die Störung der Mtor-Expression eine gängige Strategie, um Stressantworten, mitochondriale Homöostase und Entscheidungen über das Zellschicksal zu analysieren.

mTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mtor-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mtor-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mtor-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mTOR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mtor-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mTOR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mTOR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mtor-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.